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流式细胞仪原理及应用

2016-11-03 17:29:41 2415

[导读]对于专业人员来说,每一种仪器都有它的作用,那么流式细胞仪有什么用呢?它的原理又是什么呢?我们一起来了解一下。

       对于一个学文科的人来说,唯一接触过的化学仪器就是初中化学课上用显微镜观察过叶片的脉络。科技发展到今天,很多事情都可以借助高科技一起来完成。对于专业人员来说,每一种仪器都有它的作用,那么流式细胞仪有什么用呢?它的原理又是什么呢?我们一起来了解一下。


流式细胞仪原理


       流式细胞仪是什么

       流式细胞仪,又称为荧光激活细胞分选器,它是利用流式细胞术的原理,将经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中,用高压将其压入流动室内,流动室内充满鞘液,在鞘液的包裹和推动下,细胞被排成单列,以一定速度从流动室喷嘴喷出,在与细胞液流呈90°方向上,激光束照射液流,使细胞产生散射光和荧光,通过光学系统检测并接收这些光学信号,同时将其转换成电脉冲信号,电脉冲信号经过计算机处理,得出每个细胞的多种信息参数。

       它是集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器,已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断,对淋巴细胞群和亚群进行精确分类,还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备,染色后也能在荧光显微镜下进行观察,在某些实验条件下,活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。


流式细胞仪原理


       流式细胞仪原理

       流式细胞仪能“看到”的物体大小是微米级的细胞或颗粒,波长范围多在可见光范围内。

       流式细胞仪的原理,简而言之就是一定波的激光束直接照射到 高压驱动的液流,产生的光信号被多个接收器接收,一个是在激光束直 线方向上接收到的前向角散射光信号,其他的是在激光束垂直方向上 接收到的光信号,包括侧向角散射光信号和荧光信号。液流中悬浮的 细胞能够使激光束发生散射,而细胞上结合的荧光素被激光激发后能 够发射波长高于激发光的荧光,散射光信号和荧光信号被相应的接收 器掊收后,根据接收到信号的强弱就能反映出每个细胞的物理和化学 特征。

       具体来讲就是,待测样本被制备成单个细胞悬液,将感兴趣的部分经特异性荧光染料染色,置于流式细 胞仪的样品室。经样品管,在气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液,在鞘液的约束 下。细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,成为细胞液柱。液柱与入射的激光束垂直相交,相交点称为测量区。通过测量区的细胞被激发产生荧光。在与入射光束和液柱垂直的方向放置透镜、反射镜、滤光片等光学元件和检测器,用以收集散射光信号以及荧光信号。被收集的荧光信号经电子电路处理放大后,输人计算机。经计算机处理,得出可以判读到该检测样本 性质、数量的数字信息。

       各种型号的流式细胞仪虽然差别较大,但其基本结构却是相同的, 一般可以分为几个系统,包括液流系统、光路系统、检测分析系统和分 选系统。分析型流式细胞仪主要由前面3个系统组成,分选型流式细 胞仪比分析型流式细胞仪多了 1个分选系统。


流式细胞仪原理


       流式细胞仪应用

       1、在肿瘤学中的应用

       发现癌前病变,协助肿瘤早期诊断;在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用。

       这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析,将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G1期,S期和G2期),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。

       2、在临床中的作用

       FCM通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析,进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。有大量文章介绍了淋巴细胞亚群等在各种疾病中的变化。正常人群淋巴细胞T4/T8比值大约为2∶1,但在人体细胞免疫力低下时可出现比例倒置。用FCM还可以监测肾移植后病人的肾排斥反应,如果T4/T8比例倒置,病人预后良好,较少发生肾排异现象;反之排异危险性增加。同样此种测定技术也用于艾滋病的诊断和治疗中。还有作者报告了外周血淋巴细胞免疫表型的参考值,并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了探讨。

       3、在血液病诊断和治疗中的应用

       FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析,对各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。

       (1)白血病的诊断和治疗

       (2)其它种类血液病的诊断和治疗监测

       (3)网织红细胞的测定及临床应用

       4、在血栓与出血性疾病中的应用

       (1)血小板功能的测定:正常情况下血小板以分散状态在血管内运行,但当血管损伤、血流改变或受到化学物质刺激时血小板被活化而发生一系列改变。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断,FCM测定血小板膜糖蛋白的表达情况成为检查血小板功能的一种新手段[11]。该方法灵敏、特异性高。如果采用全血法测定,只需微量标本,适合于儿童及血小板减少性疾病的患者[12]。 血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生显著改变,FCM可以通过单抗免疫荧光标记(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62,CD63等)监测血小板功能及活化情况,有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。

       此外血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化,借助于钙离子敏感荧光探针的帮助,用FCM测定钙离子浓度,可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。

       (2)血小板相关抗体的测定:免疫性血小板减少性紫癜病人血浆中可产生血小板自身抗体,结合在血小板表面,称为血小板相关抗体,其分子可以是IgG、IgA或IgM,用羊抗人IgG、IgA、IgM荧光抗体标记被测血小板,FCM可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体,间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测,具有检测速度快、灵敏度高的优点。


流式细胞仪应用

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